Die Flüssigkeitschromatographie ist die Hauptmethode zum Testen des Gehalts jeder Komponente und der Verunreinigungen in Rohstoffen, Zwischenprodukten, Zubereitungen und Verpackungsmaterialien. Für viele Substanzen gibt es jedoch keine Standardmethoden, auf die man sich verlassen kann, sodass die Entwicklung neuer Methoden unumgänglich ist. Bei der Entwicklung von Flüssigphasenmethoden ist die Chromatographiesäule das Herzstück der Flüssigkeitschromatographie. Daher ist die Auswahl einer geeigneten Chromatographiesäule von entscheidender Bedeutung. In diesem Artikel erklärt der Autor, wie man eine Flüssigkeitschromatographiesäule unter drei Gesichtspunkten auswählt: Gesamtideen, Überlegungen und Anwendungsbereich.
A. Allgemeine Ideen zur Auswahl von Flüssigchromatographiesäulen
1. Bewerten Sie die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Analyten: wie chemische Struktur, Löslichkeit, Stabilität (z. B. ob er leicht oxidiert/reduziert/hydrolysiert werden kann), Säuregehalt und Alkalität usw., insbesondere die chemische Struktur ist der Schlüssel Faktor bei der Bestimmung der Eigenschaften, wie z. B. die konjugierte Gruppe weist eine starke UV-Absorption und starke Fluoreszenz auf;
2. Bestimmen Sie den Zweck der Analyse: ob eine hohe Trennung, eine hohe Säuleneffizienz, eine kurze Analysezeit, eine hohe Empfindlichkeit, eine hohe Druckbeständigkeit, eine lange Säulenlebensdauer, niedrige Kosten usw. erforderlich sind;
- Wählen Sie eine geeignete Chromatographiesäule: Verstehen Sie die Zusammensetzung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Chromatographiefüllers, wie z. B. Partikelgröße, Porengröße, Temperaturtoleranz, pH-Toleranz, Adsorption des Analyten usw.
- Überlegungen zur Auswahl von Flüssigchromatographiesäulen
In diesem Kapitel werden die Faktoren erörtert, die bei der Auswahl einer Chromatographiesäule im Hinblick auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Chromatographiesäule selbst zu berücksichtigen sind. 2.1 Füllstoffmatrix
2.1.1 Kieselgelmatrix Die Füllmatrix der meisten Flüssigchromatographiesäulen ist Kieselgel. Diese Art von Füllstoff zeichnet sich durch hohe Reinheit, geringe Kosten und hohe mechanische Festigkeit aus und lässt sich leicht mit Gruppen modifizieren (z. B. Phenylbindung, Aminobindung, Cyanobindung usw.), aber der pH-Wert und der Temperaturbereich, die er toleriert, sind begrenzt: die Der pH-Bereich der meisten Kieselgel-Matrixfüllstoffe liegt zwischen 2 und 8, aber der pH-Bereich speziell modifizierter Kieselgel-gebundener Phasen kann bis zu 1,5 bis 10 betragen, und es gibt auch speziell modifizierte Kieselgel-gebundene Phasen, die bei niedrigem pH-Wert stabil sind. wie Agilent ZORBAX RRHD Stablebond-C18, das bei pH 1 bis 8 stabil ist; Die obere Temperaturgrenze der Kieselgelmatrix liegt normalerweise bei 60 °C, und einige Chromatographiesäulen können eine Temperatur von 40 °C bei hohem pH-Wert tolerieren.
2.1.2 Polymermatrix Polymerfüllstoffe sind meist Polystyrol-Divinylbenzol oder Polymethacrylat. Ihre Vorteile bestehen darin, dass sie einen weiten pH-Bereich tolerieren – sie können im Bereich von 1 bis 14 verwendet werden – und sie sind widerstandsfähiger gegen hohe Temperaturen (können über 80 °C erreichen). Im Vergleich zu C18-Füllern auf Kieselsäurebasis weist dieser Füllstofftyp eine stärkere Hydrophobie auf und das makroporöse Polymer ist sehr effektiv bei der Trennung von Proben wie Proteinen. Die Nachteile bestehen darin, dass die Säuleneffizienz geringer ist und die mechanische Festigkeit schwächer ist als bei Füllstoffen auf Kieselsäurebasis. 2.2 Partikelform
Die meisten modernen HPLC-Füllstoffe sind kugelförmige Partikel, manchmal sind es jedoch unregelmäßige Partikel. Sphärische Partikel können einen niedrigeren Säulendruck, eine höhere Säuleneffizienz, Stabilität und eine längere Lebensdauer bieten; Bei Verwendung hochviskoser mobiler Phasen (z. B. Phosphorsäure) oder wenn die Probenlösung viskos ist, weisen unregelmäßige Partikel eine größere spezifische Oberfläche auf, was die volle Wirkung der beiden Phasen begünstigt, und der Preis ist relativ niedrig. 2.3 Partikelgröße
Je kleiner die Partikelgröße, desto höher die Säuleneffizienz und desto höher die Trennung, desto schlechter ist jedoch die Hochdruckbeständigkeit. Die am häufigsten verwendete Säule ist die Säule mit einer Partikelgröße von 5 μm. Wenn der Trennungsbedarf hoch ist, kann ein 1,5–3 μm großer Füllstoff ausgewählt werden, der zur Lösung des Trennungsproblems einiger komplexer Matrix- und Mehrkomponentenproben beiträgt. UPLC kann 1,5 μm große Füllstoffe verwenden; Füllstoffe mit einer Partikelgröße von 10 μm oder größer werden häufig für semipräparative oder präparative Säulen verwendet. 2.4 Kohlenstoffgehalt
Der Kohlenstoffgehalt bezieht sich auf den Anteil der gebundenen Phase auf der Oberfläche des Kieselgels, der mit der spezifischen Oberfläche und der Bedeckung mit der gebundenen Phase zusammenhängt. Ein hoher Kohlenstoffgehalt sorgt für eine hohe Säulenkapazität und eine hohe Auflösung und wird oft für komplexe Proben verwendet, die eine hohe Trennung erfordern. Aufgrund der langen Wechselwirkungszeit zwischen den beiden Phasen ist die Analysezeit jedoch lang; Chromatographiesäulen mit niedrigem Kohlenstoffgehalt haben eine kürzere Analysezeit und können unterschiedliche Selektivitäten aufweisen. Sie werden häufig für einfache Proben verwendet, die eine schnelle Analyse erfordern, und für Proben, die hohe Bedingungen in der wässrigen Phase erfordern. Im Allgemeinen liegt der Kohlenstoffgehalt von C18 zwischen 7 % und 19 %. 2.5 Porengröße und spezifische Oberfläche
HPLC-Adsorptionsmedien sind poröse Partikel und die meisten Wechselwirkungen finden in den Poren statt. Daher müssen Moleküle in die Poren eindringen, um adsorbiert und abgetrennt zu werden.
Porengröße und spezifische Oberfläche sind zwei komplementäre Konzepte. Kleine Porengröße bedeutet große spezifische Oberfläche und umgekehrt. Eine große spezifische Oberfläche kann die Wechselwirkung zwischen Probenmolekülen und gebundenen Phasen erhöhen, die Retention verbessern, die Probenbeladung und Säulenkapazität erhöhen und komplexe Komponenten trennen. Zu dieser Art von Füllstoffen zählen vollporöse Füllstoffe. Bei hohen Trennanforderungen empfiehlt sich die Wahl von Füllstoffen mit großer spezifischer Oberfläche; Eine kleine spezifische Oberfläche kann den Gegendruck verringern, die Säuleneffizienz verbessern und die Gleichgewichtszeit verkürzen, was für die Gradientenanalyse geeignet ist. Zu dieser Art von Füllstoffen zählen Kern-Schale-Füllstoffe. Um die Trennung zu gewährleisten, wird empfohlen, Füllstoffe mit kleiner spezifischer Oberfläche zu wählen, wenn hohe Anforderungen an die Analyseeffizienz gestellt werden. 2.6 Porenvolumen und mechanische Festigkeit
Porenvolumen, auch „Porenvolumen“ genannt, bezieht sich auf die Größe des Hohlraumvolumens pro Partikeleinheit. Es kann die mechanische Festigkeit des Füllstoffs gut widerspiegeln. Die mechanische Festigkeit von Füllstoffen mit großem Porenvolumen ist etwas schwächer als die von Füllstoffen mit kleinem Porenvolumen. Füllstoffe mit einem Porenvolumen von weniger als oder gleich 1,5 ml/g werden hauptsächlich für die HPLC-Trennung verwendet, während Füllstoffe mit einem Porenvolumen von mehr als 1,5 ml/g hauptsächlich für die molekulare Ausschlusschromatographie und die Niederdruckchromatographie verwendet werden. 2.7 Kappungsrate
Durch die Verkappung können Tailing-Peaks reduziert werden, die durch die Wechselwirkung zwischen Verbindungen und exponierten Silanolgruppen verursacht werden (z. B. Ionenbindung zwischen alkalischen Verbindungen und Silanolgruppen, Van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen sauren Verbindungen und Silanolgruppen), wodurch die Säuleneffizienz und die Peakform verbessert werden . Unverkappte gebundene Phasen erzeugen unterschiedliche Selektivitäten im Vergleich zu verkappten gebundenen Phasen, insbesondere bei polaren Proben.
- Anwendungsbereich verschiedener Flüssigkeitschromatographiesäulen
In diesem Kapitel wird der Anwendungsbereich verschiedener Arten von Flüssigkeitschromatographiesäulen anhand einiger Fälle beschrieben.
3.1 Umkehrphasen-C18-Chromatographiesäule
Die C18-Säule ist die am häufigsten verwendete Umkehrphasensäule, die die Gehalts- und Verunreinigungstests der meisten organischen Substanzen erfüllen kann und auf mittelpolare, schwach polare und unpolare Substanzen anwendbar ist. Typ und Spezifikation der C18-Chromatographiesäule sollten entsprechend den spezifischen Trennanforderungen ausgewählt werden. Beispielsweise werden für Stoffe mit hohen Trennanforderungen häufig Spezifikationen von 5 μm*4,6 mm*250 mm verwendet; Für Stoffe mit komplexen Trennmatrizen und ähnlicher Polarität können Spezifikationen von 4 μm*4,6 mm*250 mm oder kleinere Partikelgrößen verwendet werden. Beispielsweise verwendete der Autor eine 3 μm*4,6 mm*250 mm-Säule, um zwei genotoxische Verunreinigungen im Celecoxib-API nachzuweisen. Die Trennung der beiden Substanzen kann 2,9 erreichen, was ausgezeichnet ist. Darüber hinaus wird unter der Voraussetzung der Sicherstellung der Trennung häufig eine kurze Säule von 10 mm oder 15 mm ausgewählt, wenn eine schnelle Analyse erforderlich ist. Als der Autor beispielsweise LC-MS/MS zum Nachweis einer genotoxischen Verunreinigung im Piperaquinphosphat-API verwendete, wurde eine 3 μm*2,1 mm*100 mm-Säule verwendet. Der Abstand zwischen der Verunreinigung und der Hauptkomponente betrug 2,0 und der Nachweis einer Probe kann in 5 Minuten abgeschlossen sein. 3.2 Umkehrphasen-Phenylsäule
Die Phenylsäule ist ebenfalls eine Art Umkehrphasensäule. Dieser Säulentyp weist eine hohe Selektivität für aromatische Verbindungen auf. Wenn die Reaktion aromatischer Verbindungen, die mit einer gewöhnlichen C18-Säule gemessen werden, schwach ist, können Sie einen Austausch der Phenylsäule in Betracht ziehen. Als ich beispielsweise Celecoxib API herstellte, war die Reaktion der Hauptkomponente, gemessen mit der Phenylsäule desselben Herstellers und derselben Spezifikation (alle 5 μm*4,6 mm*250 mm), etwa siebenmal so hoch wie die der C18-Säule. 3.3 Normalphasensäule
Als wirksame Ergänzung zur Umkehrphasensäule eignet sich die Normalphasensäule für hochpolare Verbindungen. Wenn der Peak beim Eluieren mit mehr als 90 % wässriger Phase in der Umkehrphasensäule immer noch sehr schnell ist und sich sogar in der Nähe des Lösungsmittelpeaks befindet und mit diesem überlappt, können Sie einen Austausch der Normalphasensäule in Betracht ziehen. Zu diesem Säulentyp gehören Hilic-Säule, Amino-Säule, Cyano-Säule usw.
3.3.1 Hilic-Säule Die Hilic-Säule bettet normalerweise hydrophile Gruppen in die gebundene Alkylkette ein, um die Reaktion auf polare Substanzen zu verstärken. Dieser Säulentyp eignet sich für die Analyse von Zuckersubstanzen. Der Autor verwendete diese Art von Kolumne, als er den Inhalt und die verwandten Substanzen von Xylose und seinen Derivaten untersuchte. Auch die Isomere eines Xylose-Derivats lassen sich gut trennen;
3.3.2 Aminosäule und Cyanosäule Unter Aminosäule und Cyanosäule versteht man die Einführung von Amino- bzw. Cyanomodifikationen am Ende der gebundenen Alkylkette, um die Selektivität für spezielle Substanzen zu verbessern: Beispielsweise ist die Aminosäule eine gute Wahl zur Trennung von Zuckern, Aminosäuren, Basen und Amiden; Die Cyanosäule weist aufgrund des Vorhandenseins konjugierter Bindungen eine bessere Selektivität bei der Trennung von hydrierten und nichthydrierten strukturähnlichen Substanzen auf. Aminosäule und Cyanosäule können oft zwischen Normalphasensäule und Umkehrphasensäule umgeschaltet werden, ein häufiger Wechsel wird jedoch nicht empfohlen. 3.4 Chirale Säule
Chirale Säulen eignen sich, wie der Name schon sagt, für die Trennung und Analyse chiraler Verbindungen, insbesondere im Pharmabereich. Dieser Säulentyp kann in Betracht gezogen werden, wenn herkömmliche Umkehrphasen- und Normalphasensäulen die Trennung von Isomeren nicht erreichen können. Beispielsweise verwendete der Autor eine 5 μm*4,6 mm*250 mm große chirale Säule, um die beiden Isomere von 1,2-Diphenylethylendiamin zu trennen: (1S, 2S)-1, 2-Diphenylethylendiamin und (1R, 2R)-1, 2 -Diphenylethylendiamin, und der Abstand zwischen den beiden erreichte etwa 2,0. Allerdings sind chirale Säulen teurer als andere Säulentypen, normalerweise 1 W+/Stück. Wenn Bedarf an solchen Säulen besteht, muss die Einheit über ein ausreichendes Budget verfügen. 3.5 Ionenaustauschersäule
Ionenaustauschersäulen eignen sich zur Trennung und Analyse geladener Ionen, wie z. B. Ionen, Proteine, Nukleinsäuren und einige Zuckerstoffe. Je nach Füllstofftyp werden sie in Kationenaustauschersäulen, Anionenaustauschersäulen und starke Kationenaustauschersäulen unterteilt.
Zu den Kationenaustauschersäulen zählen kalziumbasierte und wasserstoffbasierte Säulen, die sich vor allem für die Analyse kationischer Substanzen wie Aminosäuren eignen. Beispielsweise verwendete der Autor bei der Analyse von Calciumgluconat und Calciumacetat in einer Spüllösung Säulen auf Calciumbasis. Beide Substanzen reagierten stark bei λ=210 nm und der Trenngrad erreichte 3,0; Der Autor verwendete bei der Analyse glukosebezogener Substanzen wasserstoffbasierte Säulen. Mehrere wichtige verwandte Substanzen – Maltose, Maltotriose und Fruktose – wiesen unter Differentialdetektoren eine hohe Empfindlichkeit auf, mit einer Nachweisgrenze von nur 0,5 ppm und einem Trenngrad von 2,0–2,5.
Anionenaustauschersäulen eignen sich vor allem für die Analyse anionischer Substanzen wie organische Säuren und Halogenionen; Starke Kationenaustauschsäulen verfügen über eine höhere Ionenaustauschkapazität und Selektivität und eignen sich für die Trennung und Analyse komplexer Proben.
Das Obige ist lediglich eine Einführung in die Typen und Anwendungsbereiche mehrerer gängiger Flüssigkeitschromatographiesäulen, kombiniert mit der eigenen Erfahrung des Autors. Es gibt weitere spezielle Arten von Chromatographiesäulen in tatsächlichen Anwendungen, wie z. B. großporige Chromatographiesäulen, kleinporige Chromatographiesäulen, Affinitätschromatographiesäulen, Multimode-Chromatographiesäulen, Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesäulen (UHPLC), überkritische Flüssigkeitschromatographiesäulen ( SFC) usw. Sie spielen in verschiedenen Bereichen eine wichtige Rolle. Der spezifische Typ der Chromatographiesäule sollte entsprechend der Struktur und den Eigenschaften der Probe, den Trennanforderungen und anderen Zwecken ausgewählt werden.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 14. Juni 2024