Prinzipien und Methoden der quantitativen Analyse durch Flüssigkeitschromatographie

Der Trennmechanismus der Flüssigkeitschromatographie basiert auf der unterschiedlichen Affinität der Komponenten in der Mischung für die beiden Phasen.

Entsprechend den verschiedenen stationären Phasen wird die Flüssigkeitschromatographie in Flüssig-Fest-Chromatographie, Flüssig-Flüssigkeits-Chromatographie und Bonded-Phase-Chromatographie unterteilt.Am weitesten verbreitet sind die Flüssig-Fest-Chromatographie mit Kieselgel als Füllstoff und die Bonded-Phase-Chromatographie mit Mikrosilika als Matrix.

Je nach Form der stationären Phase kann die Flüssigkeitschromatographie in Säulenchromatographie, Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie unterteilt werden.Je nach Adsorptionskapazität kann es in Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Gelpermeationschromatographie unterteilt werden.

In den letzten Jahren wurde dem Flüssigkeitssäulenchromatographiesystem ein Hochdruck-Flüssigkeitsflusssystem hinzugefügt, um die mobile Phase unter hohem Druck schnell fließen zu lassen und so den Trenneffekt zu verbessern, also hocheffiziente (auch als Hochdruck bezeichnete) Flüssigkeitschromatographie ist aufgetaucht.

TEIL
01 Prinzip der quantitativen Analyse der Flüssigkeitschromatographie

Zur qualitativen Quantifizierung sind reine Substanzen als Standards erforderlich;

Die Flüssigchromatographie-Quantifizierung ist eine relativ quantitative Methode: Das heißt, die Menge des Analyten in der Mischung wird anhand einer bekannten Menge einer reinen Standardprobe geschätzt

TEIL
02 Grundlage für die Quantifizierung durch Flüssigkeitschromatographie

Die Menge der gemessenen Komponente (W) ist proportional zum Antwortwert (A) (Peakhöhe oder Peakfläche), W=f×A.

Quantitativer Korrekturfaktor (f): Dies ist die Proportionalitätskonstante der quantitativen Berechnungsformel und ihre physikalische Bedeutung ist die Menge der gemessenen Komponente, die durch den Einheitsreaktionswert (Peakfläche) dargestellt wird.

Der quantitative Korrekturfaktor kann aus der bekannten Menge der Standardprobe und ihrem Antwortwert ermittelt werden.

Messen Sie den Antwortwert der unbekannten Komponente, und die Menge der Komponente kann durch den quantitativen Korrekturfaktor ermittelt werden.

TEIL
03 Allgemeine Begriffe in der quantitativen Analyse

Probe (Probe): eine Lösung, die einen Analyten für die chromatographische Analyse enthält.Unterteilt in Standard- und unbekannte Proben.

Standard: Ein reines Produkt mit bekannter Konzentration.Unbekannte Probe (unbekannt): Die Mischung, deren Konzentration getestet werden soll.

Probengewicht: Das Originalgewicht der zu prüfenden Probe.

Verdünnung: Der Verdünnungsfaktor der unbekannten Probe.

Komponente: der chromatographische Peak, der quantitativ analysiert werden soll, d. h. der Analyt, dessen Gehalt unbekannt ist.

Menge der Komponente (Amount): der Gehalt (oder die Konzentration) der zu prüfenden Substanz.

Ganzheit: Der rechnerische Prozess der Messung der Peakfläche eines chromatographischen Peaks durch einen Computer.

Kalibrierungskurve: Eine lineare Kurve des Komponentengehalts im Vergleich zum Antwortwert, die aus einer bekannten Menge einer Standardsubstanz erstellt wird und zur Bestimmung des unbekannten Gehalts des Analyten verwendet wird.

TEIL
04 Quantitative Analyse der Flüssigkeitschromatographie

1. Wählen Sie eine für die quantitative Analyse geeignete chromatographische Methode:

l Bestätigen Sie den Spitzenwert der erkannten Komponente und erreichen Sie eine Auflösung (R) von mehr als 1,5

l Bestimmen Sie die Konsistenz (Reinheit) der chromatographischen Peaks der getesteten Komponenten

l Bestimmen Sie die Nachweisgrenze und die Quantifizierungsgrenze der Methode.Empfindlichkeit und linearer Bereich

2. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve mit Standardproben unterschiedlicher Konzentration

3. Überprüfen Sie die Genauigkeit und Präzision quantitativer Methoden

4. Verwenden Sie die entsprechende Chromatographie-Management-Software, um die Probensammlung, Datenverarbeitung und Berichtsergebnisse zu implementieren

TEIL
05 Identifizierung quantitativer Peaks (qualitativ)

Identifizieren Sie jeden zu quantifizierenden chromatographischen Peak qualitativ

Verwenden Sie zunächst die Standardprobe, um die Retentionszeit (Rt) des zu quantifizierenden chromatographischen Peaks zu bestimmen.Finden Sie durch Vergleich der Retentionszeit die Komponente, die jedem chromatographischen Peak in der unbekannten Probe entspricht.Bei der chromatographischen qualitativen Methode wird die Retentionszeit mit der Standardprobe verglichen.Das Kriterium Unzureichendweitere Bestätigung (qualitativ)

1. Standardadditionsmethode

2. Verwenden Sie gleichzeitig andere Methoden: andere chromatographische Methoden (Änderung des Mechanismus, z. B. Verwendung verschiedener chromatographischer Säulen), andere Detektoren (PDA: Spektrumvergleich, Spektrumbibliothekssuche; MS: Massenspektrumanalyse, Spektrumbibliothekssuche)

3. Andere Instrumente und Methoden

TEIL
06 Bestätigung der quantitativen Peakkonsistenz

Bestätigen Sie die Konsistenz (Reinheit) des chromatographischen Peaks.

Stellen Sie sicher, dass sich unter jedem chromatographischen Peak nur eine gemessene Komponente befindet

Auf Störungen durch miteluierende Substanzen (Verunreinigungen) prüfen

Methoden zur Bestätigung der chromatographischen Peakkonsistenz (Reinheit)

Vergleich von Spektrogrammen mit Photodiodenmatrix-Detektoren (PDA).

Identifizierung der Spitzenreinheit

2996 Reinheitswinkeltheorie

In TEIL 07 häufig verwendete quantitative Methoden

Standardkurvenmethode, unterteilt in externe Standardmethode und interne Standardmethode:

1. Externe Standardmethode: am häufigsten in der Flüssigkeitschromatographie verwendet

Eine Reihe von Standardproben mit bekannten Konzentrationen wurde unter Verwendung reiner Proben der zu testenden Verbindungen als Standardproben hergestellt.bis zu seinem Ansprechwert (Peakfläche) in die Säule injiziert.
Innerhalb eines bestimmten Bereichs besteht eine gute lineare Beziehung zwischen der Konzentration der Standardprobe und dem Antwortwert, nämlich W= f×A, und es wird eine Standardkurve erstellt.

Injizieren Sie unter genau denselben Versuchsbedingungen die unbekannte Probe, um den Antwortwert der zu messenden Komponente zu erhalten.Anhand des bekannten Koeffizienten f kann die Konzentration der zu messenden Komponente ermittelt werden.

Die Vorteile der externen Standardmethode:einfache Bedienung und Berechnung, es handelt sich um eine häufig verwendete quantitative Methode;es ist nicht erforderlich, jede Komponente zu erkennen und zu eluieren;Standardprobe ist erforderlich;Die Messbedingungen der Standardprobe und der unbekannten Probe sollten konsistent sein.Das Injektionsvolumen sollte präzise sein.

Nachteile der externen Standardmethode:Die experimentellen Bedingungen müssen hoch sein, z. B. können die Empfindlichkeit des Detektors, die Flussrate und die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht geändert werden.Das Volumen jeder Injektion sollte eine gute Wiederholbarkeit aufweisen.

2. Interne Standardmethode: genau, aber mühsam, wird am häufigsten in Standardmethoden verwendet

Eine bekannte Menge des internen Standards wird dem Standard zugesetzt, um einen gemischten Standard herzustellen, und eine Reihe von Arbeitsstandards bekannter Konzentration werden hergestellt.Das Molverhältnis von Standard zu internem Standard im gemischten Standard bleibt unverändert.In die Chromatographiesäule injizieren und (Peakfläche der Standardprobe/Peakfläche der internen Standardprobe) als Antwortwert verwenden.Gemäß der linearen Beziehung zwischen dem Antwortwert und der Konzentration des Arbeitsstandards, nämlich W= f×A, wird eine Standardkurve erstellt.

Der unbekannten Probe wird eine bekannte Menge an internem Standard zugesetzt und in die Säule injiziert, um den Antwortwert der zu messenden Komponente zu erhalten.Anhand des bekannten Koeffizienten f kann die Konzentration der zu messenden Komponente ermittelt werden.

Die Merkmale der internen Standardmethode:Während des Vorgangs werden die Probe und der interne Standard miteinander vermischt und in die Chromatographiesäule injiziert. Solange das Verhältnis der Menge der gemessenen Komponente zum internen Standard in der gemischten Lösung konstant ist, ändert sich das Probenvolumen hat keinen Einfluss auf die quantitativen Ergebnisse..Die interne Standardmethode gleicht den Einfluss des Probenvolumens und sogar der mobilen Phase und des Detektors aus und ist daher genauer als die externe Standardmethode.

TEIL
08 Faktoren, die die Ergebnisse der quantitativen Analyse beeinflussen

Eine schlechte Genauigkeit kann folgende Ursachen haben:

Falsche Peakflächenintegration, Probenzersetzung oder während der Probenvorbereitung eingeführte Verunreinigungen, nicht versiegeltes Probenfläschchen, Verflüchtigung der Probe oder des Lösungsmittels, falsche Probenvorbereitung, Probleme bei der Probeninjektion, falsche Vorbereitung des internen Standards

Mögliche Gründe für mangelnde Präzision:

Falsche Peakintegration, Injektions- oder Injektorprobleme, Probenzersetzung oder während der Probenvorbereitung eingeführte Verunreinigungen, chromatographische Probleme, verschlechterte Detektorreaktion